今天喆圖小編以大豆子葉為外植體，在MS培養(yǎng)基上附加不同濃度、不同種類(lèi)的植物激素，以研究不同激素組合和不同濃度對(duì)大豆子葉愈傷誘導(dǎo)率的影響。

接下來(lái)給大家講講實(shí)驗(yàn)與方法所需實(shí)驗(yàn)材料：大豆子葉

實(shí)驗(yàn)所需試劑與儀器：
     試劑：75%酒精、MS干粉、蔗糖、瓊脂、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、無(wú)菌水、生汞、NaOH溶液
     儀器：超菌凈工作臺(tái)、圓紙片、培養(yǎng)皿、封口膜、稱(chēng)量紙、千分之一天平、不銹鋼杯子、移液槍、試管、高壓滅菌鍋、注射器、酒精燈、鑷子、手術(shù)刀、擱置架、燒杯、加熱板。

實(shí)驗(yàn)方法
配制培養(yǎng)基的準(zhǔn)備階段
   （1）準(zhǔn)備60個(gè)培養(yǎng)試管及封口膜，2個(gè)小培養(yǎng)皿、1個(gè)大培養(yǎng)皿，用洗衣粉、自來(lái)水洗凈，再用蒸餾水把每個(gè)培養(yǎng)試管、潤(rùn)洗一下，于鼓風(fēng)干燥箱120℃中烘干后將試管編號(hào)1-60。

   （2）在稱(chēng)量紙上用百分之一天平分別稱(chēng)取1.5g 瓊脂4份，7.5g 蔗糖4份，在燒杯里用千分之一天平上稱(chēng)取1.185g MS干粉4份。
   （3）剪小圓紙片40張，均分在兩個(gè)小培養(yǎng)皿中大小能從中自由取出為宜；剪大圓紙片10張，均分在兩個(gè)大培養(yǎng)皿中，然后分別用報(bào)紙包好。

   （4）把接種工具手術(shù)刀、鑷子、剪刀等用報(bào)紙包好。

配制培養(yǎng)基
      1、在裝有MS干粉的燒杯中按下表加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 實(shí)驗(yàn)所用的所有激素濃度均為0.5mg/mL。

      2、用量筒量取250ml蒸餾水，取一個(gè)不銹鋼杯子加入150ml蒸餾水和稱(chēng)量好的瓊脂，在加熱板上加熱沸騰2min，再加入混合好的MS培養(yǎng)基1號(hào)和蔗糖，混合沸騰2min，用剩余的蒸餾水定容至250ml；
      3、當(dāng)溫度降到60℃左右時(shí)，將溶液pH 調(diào)至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；
      4、取編號(hào)1-20的培養(yǎng)試管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培養(yǎng)基分裝在培養(yǎng)試管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。
      5、用相同的方法配置2-4號(hào)培養(yǎng)基，并分裝、捆扎。

 高壓濕熱滅菌
     ①將包好的接種工具，包好的培養(yǎng)皿，以及分裝好的試管一起放到高溫滅菌鍋中用二次排氣法在121℃滅菌20min。

     ②高壓滅菌鍋操作
      先關(guān)閉高壓滅菌鍋放氣閥, 待鍋內(nèi)壓強(qiáng)升到0.05MPa時(shí), 打開(kāi)放氣閥排出空氣, 當(dāng)壓力表指針為0MPa時(shí)關(guān)閉放氣閥。繼續(xù)加熱, 當(dāng)壓力表再次升到0.05MPa時(shí), 再一次排除滅菌鍋內(nèi)的空氣, 使壓力表指針再次降為0MPa，關(guān)閉放氣閥。繼續(xù)加熱,讓鍋內(nèi)的壓力上升到一個(gè)大氣壓（0.103MPa），此時(shí)鍋內(nèi)溫度為121.6℃時(shí)，控制熱源，維持壓力。20min后，滅菌結(jié)束，待高壓鍋內(nèi)壓力表指針恢復(fù)到零后，開(kāi)啟壓力鍋。

接種
       實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作取50粒左右大豆子葉，分成單瓣，在洗衣粉水中仔細(xì)清洗，再用流水沖洗，備用；
        接種前，用甲醛+高錳酸鉀熏蒸接種室和培養(yǎng)室，將培養(yǎng)基及接種工具放入超凈工作臺(tái)臺(tái)面，打開(kāi)鼓風(fēng)機(jī)，打開(kāi)紫外殺菌燈；
        洗凈雙手，用75%酒精擦拭雙手，并用75%的酒精擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面和有關(guān)工具，同時(shí)噴灑接種室。

植體的滅菌
        將洗好的大豆子葉在75%的酒精中浸泡8s，把酒精倒出，迅速加入無(wú)菌水漂洗兩次，再放入生汞中浸泡2min，并用鑷子不斷攪拌，倒掉氯花汞，用無(wú)菌水漂洗7次，漂洗時(shí)，后幾次無(wú)菌水要在大豆子葉中稍許停留。MAX后轉(zhuǎn)移到大培養(yǎng)皿中備用。大培養(yǎng)皿放入少許無(wú)菌水，浸濕大豆子葉。
外植體的切割
      （1）在火焰旁打開(kāi)包接種工具的報(bào)紙，將接種工具在95%酒精中浸泡，然后用酒精燈灼燒，手不能接觸接種器械的前半部分，用火灼燒鑷子或手術(shù)刀要冷卻后方可用于外植體的接種，防止?fàn)C傷材料，兩把鑷子可輪換使用；
      （2）待接種工具冷卻后，用手術(shù)刀對(duì)大豆子葉進(jìn)行切割，切割時(shí)，一次取4粒大豆子葉放入小培養(yǎng)皿中，同方向切割完畢后選裝方向，將四個(gè)方向都切下后，再在中間補(bǔ)一刀，不要切穿。

外植體的接種
       在火焰旁打開(kāi)試管封口膜，使試管口在火焰上過(guò)一下，然后把切好的子葉放入培養(yǎng)基上，操作管呈傾斜狀態(tài)，防止菌從口掉入，將管口再次在火焰上過(guò)一下，扎上封口膜。待所有培養(yǎng)試管接種完后，4個(gè)一組捆扎，放置在培養(yǎng)架上。

觀(guān)察
      在25℃光照培養(yǎng)箱中關(guān)閉光照，黑暗下培養(yǎng)一周并觀(guān)察。
       一周后，設(shè)置為25℃，打開(kāi)光照，繼續(xù)培養(yǎng)一周，并觀(guān)察。

      兩周后，觀(guān)察培養(yǎng)試管中大豆子葉生長(zhǎng)情況！

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