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用恒溫水浴鍋提取動(dòng)物組織細(xì)胞基因組DNA

更新時(shí)間:2019-06-11  |  點(diǎn)擊率:2089

        一、儀器及試劑

        ⒈儀器:

恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)(GeneQuant)、移液器、玻璃勻漿器、離心管(滅菌)、吸頭(滅菌)

        ⒉試劑:

(1)細(xì)胞裂解緩沖液:

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

(2) 蛋白酶K: 稱(chēng)取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中,?C20℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)TE緩沖液(pH 8.0):高壓滅菌,室溫貯存。

(4)酚: CHCl3:異戊醇(25:24:1)

(5)異丙醇、冷無(wú)水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

        二、操作步驟

        ⒈取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g(0.5cm3),盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中,加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見(jiàn)組織塊,轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min,也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12~24h,間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心5min,取上清液入另一離心管中。

        ⒉加2倍體積異丙醇,倒轉(zhuǎn)混勻后,可以看見(jiàn)絲狀物,用100ul 吸頭挑出,涼干,用200ul TE 重新溶解。(可進(jìn)行PCR反應(yīng)等,需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行)

        ⒊加等量的酚? CHCl3?異戊醇振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。

        ⒋取上層溶液至另一管,加入等體積的 CHCl3?異戊醇,振蕩混勻,離心12000 rpm,5min。

        ⒌取上層溶液至另一管,加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無(wú)水乙醇,混勻后室溫沉淀2min ,離心12000 rpm ,10min。

        ⒍小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉。

        ⒎用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次,離心12000 rpm , 5min。

        ⒏小心倒掉上清液,將離心管倒置于吸水紙上,將附于管壁的殘余液滴除掉,室溫干燥。

        ⒐加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        ⒑吸取適量樣品于GeneQuant上檢測(cè)濃度和純度。

        三、常見(jiàn)問(wèn)題

        ⒈選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮,處理時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)。

        ⒉在加入細(xì)胞裂解緩沖液前,細(xì)胞必須均勻分散,以減少DNA團(tuán)塊形成。

        ⒊提取的DNA不易溶解:不純,含雜質(zhì)較多;加溶解液太少使?jié)舛冗^(guò)大。沉淀物太干燥,也將使溶解變得很困難。

        ⒋電泳檢測(cè)時(shí)DNA成涂布狀:操作不慎;污染核酸酶等。

        ⒌分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8;不純,含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下,應(yīng)加入SDS  至終濃度為0.5%,并重復(fù)步驟2~8。

        ⒍酚/ CHCl3/異戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA,可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。

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